Galvenā atšķirība - PCR pret DNS secību
PCR un DNS sekvencēšana ir divas svarīgas metodes molekulārajā bioloģijā. Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) ir process, kas rada lielu skaitu DNS fragmenta kopiju. DNS sekvencēšana ir metode, kuras rezultātā tiek iegūta precīza noteiktā DNS fragmenta nukleotīdu secība. Šī ir galvenā atšķirība starp PCR un DNS sekvencēšanu. PCR ir viens no galvenajiem posmiem, kas saistīti ar DNS sekvencēšanu.
SATURS
1. Pārskats un galvenās atšķirības
2. Kas ir PCR
3. Kas ir DNS sekvencēšana
4. Blakus salīdzinājums - PCR pret DNS sekvencēšanu
5. Kopsavilkums
Kas ir PCR?
Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) ir DNS amplifikācijas paņēmiens, ko izmanto molekulārajā bioloģijā. Tas rada tūkstošiem līdz miljoniem konkrēta DNS fragmenta kopiju. Šo metodi izstrādāja Kary Mullis 1983. gadā. Ar šo paņēmienu amplificējamais DNS fragments kalpo kā matrica, un DNS polimerāzes ferments pievieno komplementārus nukleotīdus primeram, kas pieejams PCR maisījumā. PCR reakcijas beigās tiek sintezētas daudzas parauga DNS kopijas.
Ir dažādi PCR maisījuma komponenti, tostarp DNS, DNS polimerāze (Taq polimerāze), gruntskrāsas (uz priekšu un atpakaļgaitā esošās grunts), nukleotīdi (DNS celtniecības bloki) un buferšķīdums. PCR notiek PCR iekārtas iekšpusē, un mašīnā ir jāielādē pareizs PCR maisījums un jādarbina pareizā programma. Šis paņēmiens ļauj saražot tūkstošiem līdz miljoniem konkrētas DNS daļas kopiju no ļoti maza DNS daudzuma.
PCR reakcijas notiek cikliskā veidā, lai uz gēla iegūtu redzamu daudzumu PCR produktu. PĶR reakcijā ir trīs galvenie soļi, proti, denaturēšana, grunts atlaidināšana un virknes pagarināšana, kā parādīts 01. attēlā. Šīs trīs darbības notiek trīs dažādās temperatūrās. DNS pastāv divējādā veidā ar ūdeņraža saitēm starp komplementārajām bāzēm. Pirms implikācijas dubultās virknes DNS jāatdala viens no otra. To veic, dodot augstu temperatūru. Augstā temperatūrā divkāršu DNS denaturē atsevišķos pavedienos. Tad gruntskrāsām jānonāk tuvāk konkrētā fragmenta vai DNS gēna sānu galiem. Primer ir īss viengabala DNS gabals, kas papildina mērķa secību. Uz priekšu un atpakaļ virzošie grunti atlaidina ar komplementārajām bāzēm denaturētās parauga DNS sānu malās atlaidināšanas temperatūrā. Gruntējumiem jābūt karstumizturīgiem. Kad grunti ir atkaitināti ar DNS paraugu, taq polimerāzes enzīms sāk jauno virkņu sintēzi, pievienojot nukleotīdus, kas ir komplementāri mērķa DNS. Taq polimerāze ir karstumizturīgs ferments, kas izdalīts no termofīlas baktērijas, ko sauc par Thermus aquaticus. PCR buferis uztur optimālos apstākļus taq polimerāzes iedarbībai. Šie trīs PCR reakciju posmi tiek atkārtoti, lai iegūtu nepieciešamo PCR produkta daudzumu. Pēc katras PCR reakcijas DNS kopijas skaits tiek dubultots. Tādējādi PCR var novērot eksponenciālu amplifikāciju. PCR produktus var novērot, izmantojot gēla elektroforēzi, un tos var attīrīt turpmākajiem pētījumiem.
01. attēls: galvenie PCR reakcijas posmi
PCR ir vērtīgs medicīnas un bioloģisko pētījumu līdzeklis. PCR ir īpaša vērtība tiesu ekspertīzē, jo tā var pastiprināt DNS pētījumiem no mazajiem noziedznieku paraugiem un izveidot kriminālistikas DNS profilus. PCR tiek plaši izmantots daudzās molekulārās bioloģijas jomās, tostarp genotipizēšanā, gēnu klonēšanā, mutāciju noteikšanā, DNS sekvencēšanā, DNS mikroelementos un paternitātes testēšanā utt.
02. attēls: Polimerāzes ķēdes reakcija
Kas ir DNS sekvencēšana?
DNS sekvencēšana ir precīzas nukleotīdu - adenīna, guanīna, citozīna un timīna - noteikšana noteiktā DNS fragmentā. Ģenētiskā informācija tiek glabāta DNS sekvencēs, izmantojot pareizu nukleotīdu secību. Tādējādi, lai uzzinātu par gēnu struktūru un darbību, ir ļoti svarīgi atrast precīzu nukleotīdu kārtību DNS fragmentā.
DNS sekvencēšanas protokols ietver dažādus procesus. Pirmais solis ir ieinteresētās DNS vai organisma genomiskās DNS izolēšana. Izmantojot PCR (kā aprakstīts iepriekš), vēlamais DNS reģions jāpaplašina. Pastiprinātais PCR produkts jāatdala ar gēla elektroforēzi un jāattīra. Pastiprināti fragmenti tiek izmantoti kā secības secības veidnes. Secību var veikt vai nu pēc Sangera sekvencēšanas, vai ar augstas caurlaidspējas sekvencēšanas metodi. Sanger sekvencēšanai nepieciešama iegūto DNS fragmentu kapilārā elektroforēze. Pareizu nukleotīdu secību var noteikt, manuāli nolasot autoradiogrāfus vai izmantojot automatizētus DNS sekvencerus.
Gēnu sekvencēšana veicināja cilvēka genoma projektu un atviegloja cilvēka genoma kartēšanu 2003. gadā. Kriminālistikā DNS sekvencēšana ļāva identificēt personas, kurām ir unikālas DNS sekvences un identificēti noziedznieki. Medicīnā DNS sekvencēšanu var izmantot, lai atklātu gēnus, kas ir atbildīgi par ģenētiskām un citām slimībām, atrod defektu gēnus un aizstāj tos ar pareiziem gēniem. Lauksaimniecībā dažu mikroorganismu DNS sekvencēšanas informācija tiek izmantota, lai iegūtu transgēnas kultūras ar ekonomiski vēlamām īpašībām.
03. attēls: DNS secība
Kāda ir atšķirība starp PCR un DNS sekvencēšanu?
Atšķirīgs raksts vidū pirms tabulas
PCR pret DNS secību |
|
| PĶR process rada tūkstošiem līdz miljoniem ieinteresētā DNS fragmenta kopiju. | DNS sekvencēšana ir process, kurā nosaka precīzu nukleotīdu secību noteiktā DNS fragmentā. |
| Rezultāts | |
| PCR rada tūkstošiem līdz miljoniem konkrēta DNS fragmenta kopiju | Tā rezultātā pareizā bāzu secība konkrētā DNS fragmentā. |
| DdNTP iesaistīšana | |
| PCR nav nepieciešami ddNTP. Tas izmanto dNTP. | DNS sekvencēšanai ir nepieciešami ddNTP, lai izbeigtu virknes veidošanos. |
Kopsavilkums - PCR pret DNS secību
PĶR un DNS sekvencēšana ir ļoti svarīgi instrumenti daudzās molekulārās bioloģijas jomās. DNS fragmentu pastiprināšana tiek veikta ar PCR metodi, savukārt DNS fragmenta pareizu secību nosaka DNS secība. Šī ir atšķirība starp PCR un DNS sekvencēšanu.
