Galvenā atšķirība - NGS pret Sangera secību
Nākamās paaudzes sekvencēšana (NGS) un Sangera sekvencēšana ir divu veidu nukleotīdu sekvencēšanas paņēmieni, kas izstrādāti laika gaitā. Sangera sekvencēšanas metode tika plaši izmantota daudzus gadus, un NGS to nesen aizstāja savu priekšrocību dēļ. Galvenā atšķirība starp NGS un Sangera sekvencēšanu ir tā, ka NGS darbojas pēc principa, ka vienlaikus ar sekvencēšanas sistēmu tiek ātri secīgi sastādīti miljoni miljonu secību, savukārt Sangera sekvencēšana darbojas uz ķēdes pārtraukšanas principa, pateicoties selektīvai dideoksinukleotīdu iekļaušanai DNS polimerāzes fermentā. DNS replikācijas laikā un no tā izrietošā fragmentu atdalīšana ar kapilāru elektroforēzi.
SATURS
1. Pārskats un galvenās atšķirības
2. Kas ir nukleotīdu secība
3. Kas ir NGS
4. Kas ir Sanger sekvencēšana
5. Blakus salīdzinājums - NGS vs Sanger secība
6. Kopsavilkums
Kas ir nukleotīdu secība?
Ģenētiskā informācija tiek glabāta organisma DNS vai RNS nukleotīdu sekvencēs. Pareizas nukleotīdu kārtas noteikšanas process (izmantojot četras bāzes) dotajā fragmentā (gēnā, gēnu kopā, hromosomā un pilnīgā genomā) ir pazīstams kā nukleotīdu secība. Genomu pētījumos, kriminālistikas pētījumos, viroloģijā, bioloģiskajā sistemātikā, medicīniskajā diagnostikā, biotehnoloģijā un daudzās citās jomās ir ļoti svarīgi analizēt gēnu struktūru un funkcijas. Ir dažāda veida secības noteikšanas metodes, kuras izstrādājuši zinātnieki. Starp tiem Frederika Sangera 1977. gadā izstrādātā Sanger sekvencēšana tika plaši izmantota un popularizēta ilgu laiku, līdz nākamās paaudzes secība to aizstāja.
Kas ir NGS?
Nākamās paaudzes sekvencēšana (NGS) ir termins, ko lieto, lai apzīmētu mūsdienu augstas caurlaidspējas sekvencēšanas procesus. Tajā aprakstītas vairākas dažādas mūsdienu sekvencēšanas tehnoloģijas, kas radikāli mainīja genomikas pētījumus un molekulāro bioloģiju. Šīs metodes ir Illumina sekvencēšana, Roche 454 sekvencēšana, jonu protonu sekvencēšana un SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection) sekvencēšana. NGS sistēmas ir ātrākas un lētākas. NGS sistēmās tiek izmantotas četras galvenās DNS sekvencēšanas metodes, proti; pirozsekvenēšana, sekvencēšana ar sintēzi, sekvencēšana ar ligāciju un jonu pusvadītāju sekvencēšana. Paralēli var sekvencēt lielu skaitu DNS vai RNS virkņu (miljoniem). Tas ļauj sekvencēt visu organismu genomu īsā laika periodā, atšķirībā no Sangera sekvencēšanas, kas prasa vairāk laika.
NGS ir daudz priekšrocību salīdzinājumā ar parasto sekvencēšanas Sangera metodi. Tas ir ātrgaitas, precīzāks un rentablāks process, ko var veikt ar nelielu izlases lielumu. NGS var izmantot metagenomiskos pētījumos, atsevišķu genomu variāciju noteikšanai inserciju un delēciju uc dēļ un gēnu izpausmju analīzē.
Attēls_1: NGS secības attīstība
Kas ir Sanger sekvencēšana?
Sangera sekvencēšana ir Frederika Sangera un viņa kolēģu 1977. gadā izstrādātā secības noteikšanas metode, lai noteiktu konkrētā DNS fragmenta precīzu nukleotīdu secību. To sauc arī par ķēdes pārtraukšanas sekvencēšanu vai Dideoxy sekvencēšanu. Šīs metodes darbības princips ir virknes sintēzes pārtraukšana, selektīvi iekļaujot DNS polimerāzes laikā DNS polimerāzes laikā dideoksinukleotīdus (ddNTP), piemēram, ddGTP, ddCTP, ddATP un ddTTP. Normāliem nukleotīdiem ir 3 'OH grupas fosfodiesteru saites veidošanai starp blakus esošajiem nukleotīdiem, lai turpinātu virknes veidošanos. Tomēr ddNTP nav šīs 3 'OH grupas un tie nespēj veidot fosfodiesteru saites starp nukleotīdiem. Tādējādi ķēdes pagarinājums tiek pārtraukts.
Šajā metodē sekvencējamā viena virkne DNS kalpo par matricas virkni in vitro DNS sintēzei. Citas prasības ir oligonukleotīdu grunts, dezoksinukleotīdu prekursori un DNS polimerāzes ferments. Kad ir zināmi mērķa fragmenta blakus esošie gali, grunts var viegli konstruēt DNS replikācijai. Četras atsevišķas DNS sintēzes reakcijas tiek veiktas četrās atsevišķās mēģenēs. Katrai mēģenei ir atsevišķi ddNTP, kā arī citas prasības. No konkrētā nukleotīda pievieno dNTP un ddNTP maisījumu. Tāpat četras atsevišķas reakcijas veic četrās mēģenēs ar četriem maisījumiem. Pēc reakcijām tiek veikta DNS fragmentu noteikšana un fragmentu modeļa pārveidošana par secības informāciju. Rezultātā iegūtos DNS fragmentus termiski denaturē un atdala ar gēla elektroforēzi. Ja tiek izmantoti radioaktīvie nukleotīdi, joslu modeli poliakrilamīda gēlā var vizualizēt ar autoradiogrāfiju. Ja šajā metodē tiek izmantoti fluorescējoši marķēti dideoksinukleotīdi, to var mazināt pa nolasīto gēlu un izlaist caur lāzera staru, lai to noteiktu fluorescējošais detektors. Lai izvairītos no kļūdām, kas varētu rasties, kad secība tiek nolasīta ar aci un manuāli ievadīta datorā, šī metode tika izveidota, izmantojot automatizētu sekvenceri kopā ar datoru. Lai izvairītos no kļūdām, kas varētu rasties, kad secība tiek nolasīta ar aci un manuāli ievadīta datorā, šī metode tika izveidota, izmantojot automatizētu sekvenceri kopā ar datoru. Lai izvairītos no kļūdām, kas varētu rasties, kad secība tiek nolasīta ar aci un manuāli ievadīta datorā, šī metode tika izveidota, izmantojot automatizētu sekvenceri kopā ar datoru.
Šī ir metode, ko izmanto DNS secībai no cilvēka genoma projekta. Šī metode joprojām tiek izmantota ar uzlabotām modifikācijām, jo tā sniedz precīzu informāciju par secību, neskatoties uz to, ka tā ir dārga un lēna.
Attēls_2: Sangera secība
Kāda ir atšķirība starp NGS un Sanger sekvencēšanu?
Atšķirīgs raksts vidū pirms tabulas
NGS vs Sangera secība |
|
| Nākamās paaudzes sekvencēšana (NGS) attiecas uz mūsdienu augstas caurlaidspējas secības noteikšanas procesiem. Tajā aprakstītas vairākas dažādas mūsdienu sekvencēšanas tehnoloģijas | Sangera sekvencēšana ir Frederika Sangera izstrādāta sekvencēšanas metode, lai noteiktu konkrētā DNS fragmenta precīzu nukleotīdu secību. |
| Rentabilitāte | |
| NGS ir lētāks process, jo tas samazina laiku, cilvēka jaudu un ķīmiskās vielas. | Tas ir dārgs process, jo tas prasa laiku, cilvēka spēku un vairāk ķīmisko vielu. |
| Ātrums | |
| Tas ir ātrāk, jo paralēli notiek gan ķīmiska, gan daudzu virkņu signālu noteikšana. | Tas ir laikietilpīgi, jo ķīmiskā noteikšana un signāla noteikšana notiek kā divi atsevišķi procesi, un vienlaikus tos var lasīt tikai virknē. |
| Uzticamība | |
| NGS ir uzticama. | Sanger sekvencēšana ir mazāk uzticama |
| Parauga lielums | |
| NGS nepieciešams mazāks DNS daudzums. | Šai metodei nepieciešams liels daudzums DNS matricas. |
| DNS bāzes vienā secīgajā fragmentā | |
| DNS bāzu skaits vienā secīgā fragmentā ir mazāks nekā Sangera metode | Ģenerējošās sekvences ir garākas nekā NGS sekvences. |
Kopsavilkums - NGS vs Sangera secība
NGS un Sangera sekvencēšana ir nukleotīdu sekvencēšanas paņēmieni, ko plaši izmanto molekulārajā bioloģijā. Sanger sekvencēšana ir agrīna sekvencēšanas metode, kuru aizstāja NGS. Galvenā atšķirība starp NGS un Sangera secību ir tā, ka NGS ir ātrgaitas, precīzāks un rentablāks process nekā Sangera sekvencēšana. Abas metodes radīja nozīmīgus ģenētikas un biotehnoloģijas uzliesmojumus.
