Galvenā atšķirība - Sanger sekvencēšana vs Pyrosequencing
DNS sekvencēšana ir ļoti svarīga DNS analīzei, jo zināšanas par pareizu nukleotīdu izvietojumu noteiktā DNS reģionā atklāj daudz svarīgas informācijas par to. Ir dažādas DNS sekvencēšanas metodes. Sangera sekvencēšana un pirosekvenēšana ir divas dažādas DNS sekvencēšanas metodes, ko plaši izmanto molekulārajā bioloģijā. Galvenā atšķirība starp Sangera sekvencēšanu un pirosekvenēšanu ir tā, ka Sangera sekvencēšana izmanto dideoksinukleotīdus, lai izbeigtu DNS sintēzi, lai lasītu nukleotīdu secību, savukārt pirozsekvenācija nosaka pirofosfāta izdalīšanos, iekļaujot nukleotīdus un sintezējot komplementāro secību, lai nolasītu precīzu secību secībā.
SATURS
1. Pārskats un galvenās atšķirības
2. Kas ir Sanger sekvencēšana
3. Kas ir Pyrosequencing
4. Blakus salīdzinājums - Sanger sekvencēšana vs Pyrosequencing
5. Kopsavilkums
Kas ir Sanger sekvencēšana?
Sanger sekvencēšana ir pirmās paaudzes DNS sekvencēšanas metode, ko Frederiks Sangers un viņa koledžas izstrādāja 1977. gadā. Tā ir pazīstama arī kā ķēdes gala sekvencēšana vai dideoksi sekvencēšana, jo tā balstās uz ķēdes pārtraukšanu ar dideoksinukleotīdiem (ddNTP). Šī metode tika plaši izmantota vairāk nekā 30 gadus, līdz tika izstrādāta Jaunās paaudzes secība (NGS). Sangera sekvencēšanas tehnika ļāva atklāt pareizu nukleotīdu secību vai piestiprināt noteiktu DNS fragmentu. Tas ir balstīts uz selektīvu ddNTP iekļaušanu un DNS sintēzes pārtraukšanu in vitro DNS replikācijas laikā. 3 'OH grupu trūkums, lai turpinātu fosfodiesteru saites veidošanos starp blakus esošajiem nukleotīdiem, ir unikāla ddNTP iezīme. Tādējādi, kad ddNTP ir pievienots, ķēdes pagarinājums beidzas un beidzas no šī punkta. Sangera sekvencēšanā tiek izmantoti četri ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP un ddTTP. Šie nukleotīdi aptur DNS replikācijas procesu, kad tie ir iekļauti augošajā DNS virknē, un to rezultātā mainās īss DNS garums. Kapilārā gēla elektroforēzi izmanto, lai sakārtotu šīs īsās DNS virknes pēc to izmēriem uz gēla, kā parādīts 01. attēlā.
1. attēls: sintezētās īsās DNS kapilārā gēla elektroforēze
DNS replikācijai in vitro būtu jāparedz dažas prasības. Tie ir DNS polimerāzes enzīms, matricas DNS, oligonukleotīdu grunts un dezoksinukleotīdi (dNTP). Sangera sekvencēšanā DNS replikāciju veic četrās atsevišķās mēģenēs kopā ar četru veidu ddNTP atsevišķi. Dezoksinukleotīdi nav pilnībā aizstāti ar attiecīgajiem ddNTP. Mēģenē tiek ievietots un atkārtots konkrētā dNTP maisījums (piemēram, dATP + ddATP). Četrus atsevišķus mēģenes produktus darbina ar želeju četrās atsevišķās iedobēs. Tad, nolasot gēlu, secību var izveidot, kā parādīts 02. attēlā.
02. attēls: Sanger sekvencēšana
Sangera sekvencēšana ir svarīga tehnika, kas palīdz daudzās molekulārās bioloģijas jomās. Cilvēka genoma projekts tika veiksmīgi pabeigts, izmantojot Sangera uz sekvencēšanu balstītas metodes. Sanger sekvencēšana ir noderīga arī mērķa DNS sekvencēšanā, vēža un ģenētisko slimību izpētē, gēnu ekspresijas analīzē, cilvēka identificēšanā, patogēnu noteikšanā, mikrobu sekvencēšanā utt.
Sanger sekvencēšanai ir vairāki trūkumi:
- Sekvencētās DNS garums nevar būt lielāks par 1000 bāzes pāriem
- Vienlaicīgi var secēt tikai vienu virkni.
- Process ir laikietilpīgs un dārgs.
Tāpēc, lai pārvarētu šīs problēmas, ar laiku tika izstrādātas jaunas uzlabotas sekvencēšanas metodes. Tomēr Sangera sekvencēšana joprojām tiek izmantota, pateicoties ļoti precīziem rezultātiem līdz aptuveni 850 bāzes pāra garuma fragmentiem.
Kas ir pirosekvence?
Pirosekvenēšana ir jauna DNS sekvencēšanas tehnika, kuras pamatā ir “sekvencēšana sintēzes ceļā”. Šis paņēmiens balstās uz pirofosfāta izdalīšanās noteikšanu pēc nukleotīdu iekļaušanas. Šo procesu izmanto četri dažādi fermenti: DNS polimērs, ATP sulfurilāze, luciferāze un apirāze un divi substrāti - adenozīna 5 'fosfosulfāts (APS) un luciferīns.
Process sākas ar grunts saistīšanos ar vienpavediena DNS šablonu un DNS polimerāze sāk tam komplementāru nukleotīdu iekļaušanu. Kad nukleotīdi savienojas kopā (nukleīnskābes polimerizācija), tas atbrīvo pirofosfāta (divas kopā sasaistītas fosfātu grupas) grupas un enerģiju. Katra nukleotīdu pievienošana atbrīvo ekvimolāru daudzumu pirofosfāta. Pirofosfāts pārvēršas ATP ar ATP sulfurilāzi substrāta APS klātbūtnē. Radītais ATP virza luciferāzes mediēto luciferīna pārveidošanos par oksiluciferīnu, radot redzamu gaismu daudzumos, kas ir proporcionāli ATP daudzumam. Gaisma tiek atklāta ar fotonu noteikšanas ierīci vai ar fotopalielinātāju un izveido pirogrammu. Apirāze noārda ATP un neiekļautos dNTP reakcijas maisījumā. dNTP pievienošana tiek veikta vienlaicīgi. Tā kā nukleotīda pievienošana ir zināma pēc gaismas iekļaušanas un noteikšanas, var noteikt šablona secību. Pirogrammu izmanto, lai ģenerētu parauga DNS nukleotīdu secību, kā parādīts 03. attēlā.
Pirosekvenēšana ir ļoti svarīga viena nukleotīda polimorfisma analīzē un nelielu DNS posmu secībā. Augsta precizitāte, elastība, automatizācijas vieglums un paralēla apstrāde ir pirosekvenēšanas priekšrocības salīdzinājumā ar Sangera sekvencēšanas paņēmieniem.
03. attēls: Pirosekvensēšana
Kāda ir atšķirība starp Sanger sekvencēšanu un Pyrosequencing?
Atšķirīgs raksts vidū pirms tabulas
Sanger sekvencēšana vs Pyrosequencing |
|
| Sanger sekvencēšana ir DNS sekvencēšanas metode, kuras pamatā ir selektīva ddNTP iekļaušana, izmantojot DNS polimerāzi un ķēdes pārtraukšanu. | Pirosekvenēšana ir DNS sekvencēšanas metode, kuras pamatā ir pirofosfāta izdalīšanās noteikšana, iekļaujot nukleotīdu. |
| DdNTP izmantošana | |
| ddNTP izmanto, lai izbeigtu DNS replikāciju | ddNTP netiek izmantoti. |
| Iesaistītie fermenti | |
| Tiek izmantota DNS polimerāze. | Tiek izmantoti četri fermenti: DNS polimerāze, ATP sulfurilāze, Luciferāze un Apirāze. |
| Izmantotās pamatnes | |
| APS un Luciferīnu neizmanto. | Tiek izmantots adenozīna 5 'fosfosulfāts (APS) un luciferīns. |
| Maksimālā temperatūra | |
| Tas ir lēns process. | Tas ir ātrs process. |
Kopsavilkums - Sanger sekvencēšana vs Pyrosequencing
Sanger sekvencēšana un Pyrosequencing ir divas DNS sekvencēšanas metodes, ko izmanto molekulārajā bioloģijā. Sangera sekvencēšana konstruē nukleotīdu secību secībā, pārtraucot ķēdes pagarinājumu, bet pirosekvensēšana veido precīzu secību pēc nukleotīdu secības, iekļaujot nukleotīdus un nosakot pirofosfātu izdalīšanos. Tāpēc galvenā atšķirība starp Sangera sekvencēšanu un pirosekvenēšanu ir tā, ka Sangera sekvencēšana darbojas pēc sekvencēšanas ar ķēdes pārtraukumu, bet pirosekvenēšana uz sekvencēšanu ar sintēzi.
