Galvenā atšķirība - Maxam Gilbert vs Sanger Sekvences
Nukleotīdi ir DNS strukturālās vienības un pamatelementi. DNS molekulu veido polinukleotīdu ķēde. DNS atrodami četri dažādi nukleotīdi. Šie nukleotīdi sastāv no četrām dažādām slāpekļa bāzēm ar nosaukumu A (adenīns), G (guanīns), C (citozīns), T (timīns). DNS molekulas nukleotīdu secībai ir liela nozīme, jo tā kodē svarīgu ģenētisko informāciju par organismu augšanu un attīstību. DNS sekvencēšana attiecas uz procesu, kas nosaka precīzu DNS nukleotīdu secību. Ir dažādas DNS sekvencēšanas metodes. Maksama Džilberta sekvencēšana un Sangera DNS sekvencēšana ir divas DNS sekvencēšanas metodes, kas pieder pirmās paaudzes sekvencēšanai. Maksama Džilberta sekvencēšanas procedūra nosaka bāzes secību, ķīmiski šķeļot ar 5 'galu iezīmētos DNS fragmentus katrā no četriem nukleotīdiem un gēla elektroforēzi. Sangera sekvencēšanas procedūra nosaka nukleotīdu secību, sintezējot vienpavediena DNS, izmantojot DNS polimerāzi un dideoksinukleotīdus, kā arī gēla elektroforēzi. Šī ir galvenā atšķirība starp Maxam Gilbert un Sanger Sequencing.
SATURS
1. Pārskats un galvenās atšķirības
2. Kas ir Maxam Gilbert
3. Kas ir Sanger sekvencēšana
4. Blakus salīdzinājums - Maxam Gilbert vs Sanger sekvencēšana
5. Kopsavilkums
Kas ir Maksama Žilberta sekvencēšana?
Maksama Džilberta sekvencēšana, kas pazīstama arī kā ķīmiskās sekvencēšanas metode, ir tehnika, kas tika izstrādāta, lai noteiktu DNS nukleotīdu secību. Šo metodi 1976. gadā ieviesa Valters Gilberts un Alans Maksams, un tā kļuva populāra, jo to var veikt tieši ar attīrītu DNS. Maksama Džilberta metode pieder pie pirmās DNS sekvencēšanas paaudzes, un tā bija pirmā secības noteikšanas metode, ko zinātnieki plaši izmantoja.
Šīs metodes pamatprincips ir ar galu iezīmēto DNS fragmentu ierobežošana noteiktās bāzēs ar specifiskām ķīmiskajām vielām un apstākļiem, kā arī marķēto fragmentu atdalīšana ar elektroforēzi, kā parādīts 01. attēlā. Fragmenti tiek atdalīti pēc to izmēriem želeja. Tā kā fragmenti ir marķēti, var viegli secināt DNS molekulas secību.
Maksama Džilberta metode izmanto bāzes specifiskās ķīmiskās vielas, lai sadalītu DNS noteiktos pamatos. Divas parastās ķīmiskās vielas, ko sauc par dimetilsulfātu un hidrazīna ķīmiskām vielām, tiek izmantotas, lai selektīvi uzbruktu attiecīgi purīniem un pirimidīniem.
Maksama Džilberta sekvencēšanas metodi veic, veicot vairākas darbības šādi.
- DNS sekvences attīrīšana, izmantojot restrikcijas endonukleāzes
- DNS fragmentu galu marķēšana, pievienojot radioaktīvos fosfātus
- Marķēto fragmentu attīrīšana no nemarķētiem fragmentiem ar gēla elektroforēzi
- Ar galu iezīmētās DNS atdalīšana četrās mēģenēs un apstrāde ar bāzes specifiskām ķīmiskajām vielām atsevišķi
- Katras caurules satura elektroforēze uz atsevišķām līnijām uz gela un fragmentu atdalīšana atbilstoši to garumam.
- Fragmentu noteikšana ar autoradiogrāfu.
01. attēls: Maksama Žilberta secība
Kas ir Sanger sekvencēšana?
Sangera sekvencēšana ir Frederika Sangera un viņa kolēģu 1977. gadā izstrādātā secības noteikšanas metode, lai noteiktu attiecīgā DNS fragmenta bāzes secību. Tas ir arī pazīstams kā ķēdes pārtraukšanas secība vai Dideoksi sekvencēšanas metode. Šī metode darbojas pēc ķēdes gala dideoksinukleotīdu (ddNTP), piemēram, ddGTP, ddCTP, ddATP un ddTTP, selektīvas iekļaušanas DNS polimerāzē vienas virknes DNS sintēzes laikā, lai pārtrauktu virknes veidošanos. Dideoksinukleotīdiem trūkst 3 'OH grupu, lai izveidotos fosfodiesteru saites ar blakus esošo nukleotīdu. Tādējādi virknes veidošanās apstājas, tiklīdz ddNTP tiek iekļauts jaunizveidotajā virknē dziedātāja sekvencēšanas laikā.
Šajā metodē četras atsevišķas DNS sintēzes reakcijas (PCR) tiek veiktas četrās atsevišķās mēģenēs ar viena veida ddNTP. Citas prasības tiek piegādātas arī PCR mēģenēm, ieskaitot gruntējumus, dNTP, Taq polimerāzi, specifiskos apstākļus utt. Četras atsevišķas reakcijas veic četrās mēģenēs ar četriem maisījumiem. Pēc PCR reakcijām iegūtos DNS fragmentus termiski denaturē un atdala ar gēla elektroforēzi. Tad fragmentus vizualizē, izmantojot vai nu iezīmētu (radioaktīvu vai fluorescējošu) grunti, vai dNTP, kā parādīts 02. attēlā.
02. attēls: Sangera secība
Kāda ir atšķirība starp Maksamu Džilbertu un Sangera sekvencēšanu?
Atšķirīgs raksts vidū pirms tabulas
Maksams Žilberts vs Sangera secība |
|
| Maksama Džilberta sekvencēšana ir pirmā metode, kas izstrādāta DNS sekvencēšanai. | Sanger sekvencēšanas metode tika ieviesta pēc Maxam Gilbert sekvencēšanas metodes. |
| Lietošana | |
| Šo metodi izmanto reti. | Sekvencēšanai parasti tiek izmantota Sanger sekvencēšana. |
| Bīstamo ķīmisko vielu izmantošana | |
| Tas izmanto bīstamas ķīmiskas vielas. | Bīstamo ķīmisko vielu lietošana ir ierobežota salīdzinājumā ar Maksama Džilberta metodi. |
| Marķēšana noteikšanai | |
| Šajā metodē DNS fragmentu galu marķēšanai tiek izmantots radioaktīvs P 32. | Sangeru secībā tiek izmantoti radioaktīvi vai ar fluorescenci marķēti ddNTP. |
Kopsavilkums - Maxam Gilbert vs Sanger Sekvences
Maksama Džilberta un Sangera sekvencēšana ir divu veidu DNS sekvencēšanas paņēmieni, kas ietilpst pirmās paaudzes DNS sekvencēšanā. Maksama Džilberta sekvencēšana ir pirmā metode, kas ieviesta DNS sekvencēšanai 1976. gadā, un to veic, gala iezīmētos DNS fragmentus sadalot ar bāzes specifiskām ķīmiskajām vielām. Tādējādi to sauc par ķīmisko sekvencēšanu. Sangera sekvencēšanas metode tika ieviesta 1977. gadā, un tā balstās uz ddNTP virzītām ķēdes pārtraukšanas reakcijām. Sanger sekvencēšanas metode, kas ir populāra nekā Maxam Gilbert metode, pateicoties vairākiem Maxam Gilbert metodes trūkumiem, piemēram, pārmērīgs laika patēriņš, bīstamu ķīmisko vielu izmantošana utt. Šī ir atšķirība starp Maxam Gilbert un Sanger sekvencēšanu.
